ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)是Ras超基因家族的成员，它们是大小约20 kD的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，Ras超基因家族包括6类：Ras、Rho、Rab、Ran、Rad和ARF家族(王磊等, 2007, 细胞生物学杂志, 29: 675-681)。ARF3是ARF基因家族中比较保守、最重要的蛋白，对细胞内物质的转运起着重要作用。

香蕉属于芭蕉科芭蕉属的植物，热带地区广泛栽培食用，由于热带地区气候条件的影响，香蕉易遭受冻害、台风和病害，制约着香蕉的生产。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型侵染而引起香蕉维管束死亡的一种真菌性、靠土壤传播的病害。土壤中的病原菌侵染香蕉幼苗的根部，通过堵塞维管束组织及分泌有毒害物质危害寄主，造成植株叶片变黄，严重时整株枯萎死亡。枯萎病是制约香蕉生产的毁灭性病害，据有关记载中国大陆最早发现香蕉枯萎病是在广东省番禹市，由于该病害的传播速度快、没有有效的防治方法，造成香蕉产量大幅下降，严重制约着香蕉生产发展。目前还没有一种有效的药剂能够抑制该病的发生，也没有可靠的抗病品种，因此，探究尖孢镰刀菌古巴专化型致病相关基因对香蕉枯萎病的防治尤为重要。ARF基因家族主要功能是控制细胞内物质的运输，而如何通过调控该基因，阻断病菌分泌毒害物质的有效运输，有可能减少枯萎病的发生概率。该研究也发现ARF基因家族的ARF3基因表达与枯萎病菌之间存在响应关系，为后续研究提供很好的借鉴。

ARF基因家族主要功能是调控细胞内物质运输，关于该基因对香蕉枯萎病感染的反应及调控机理的研究还比较少。本研究试图通过克隆ARF3基因全长以及对枯萎病原菌侵染香蕉根系后的响应进行研究，了解该基因是否与香蕉枯萎病发生具有相关性提供信息。

1结果与分析
1.1香蕉ARF3基因的克隆及序列分析
通过改进的CTAB法提取的香蕉叶片总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度和OD值，浓度为370 ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.85，电泳结果显示2条主带(图1)。提取的RNA完全能够满足下游RACE反转录的需要。

图1 香蕉叶片RNA电泳结果 Figure 1 RNA of Banana leaf

利用3′-RACE和5′-RACE方法分别获得一条1 134 bp和700 bp的特异性条带(图2)，分别连接PMD-18T-Vector载体，转化DH5α，进行重组质粒的鉴定(图3)，测序后软件拼接得到1 427 bp。根据该基因开放阅读框设计引物ARF3-F和ARF3-R，以反转录的cDNA为模板扩增全长测序结果显示香蕉ARF3基因全长1427 bp (图4)，与拼接片段一致。

图2 香蕉ARF3基因5’-RACE和3’-RACE结果 Figure 2 5’-RACE and 3’-RACE of ARF3 gene

图3 5’-RACE和3’-RACE重组质粒鉴定 Figure 3 Recombinant plasmid identification of 5’-RACE and 3’-RACE

图4 ARF3基因扩增产物及重组质粒鉴定 Fig 4 Amplification products and recombinant plasmid identification of ARF3 gene

1.2香蕉ARF3基因cDNA全长核苷酸序列分析
测序得到香蕉ARF3全长1 427 bp，应用NCBI的ORF程序显示5′非翻译区为173 bp，3′非翻译区为87 bp，包含1 166 bp的开放阅读框，其中起始密码子ATG位于174 bp处，终止密码子TAA位于1340 bp处，编码338个氨基酸。

1.3香蕉ARF3基因cDNA全长核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性分析
香蕉ARF3基因全长核苷酸序列与其它植物已报道的ARF3基因具有69%~74%的相似性，氨基酸序列有81%~93%的相似性，与葡萄的相似性最高为73%，其次是玉米、水稻、苜蓿、大豆和拟南芥，相似性为71%、71%、70%、70%和69% (表1)，相似性都在68%以上。从香蕉ARF3基因推导的氨基酸序列与已知其它植物ARF3基因序列有81%~93%的相似性，其中与蓖麻的相似性最高为93%，其次是葡萄、玉米、水稻、大豆和拟南芥，相似性为92%、92%、92%、92%和88%。}

表1 香蕉ARF3基因和已知其它植物的ARF3基因核苷酸与推导的氨基酸序列相似性比较 Table 1 Banana was compared with other knowned plants in similarities about ARF3 gene nucleotide sequence and amino acids sequence

1.4病原菌侵染后不同时期香蕉根系ARF3基因表达分析
通过分析侵染不同时间后香蕉的根系，结果表明，香蕉枯萎病原菌4号生理小种侵染香蕉苗根系后0~3 d内的不同时间点，ARF3基因的表达量不同(图5)。侵染0~12 h，ARF3基因表达量呈上升趋势，12 h时表达量最高，在侵染后24 h表达量有所下降，3 d时表达量进一步的降低。结果显示，用枯萎病原菌侵染香蕉根系后，ARF3基因在根系的表达量发生有规律的变化，呈现先升高再降低的趋势，由此可以推断ARF3基因可能与香蕉枯萎病的发生存在着相关性。

图5 病原菌侵染后不同时期ARF3基因表达量差异 Figure 5 Expression differences of ARF3 gene in different periods after pathogen infection

2讨论
本研究在香蕉中获得的ARF3基因长度与王园等(2010)在香蕉中克隆的ARF1基因长度有一定的差异，该基因全长1 427 bp，而其克隆的ARF1基因全长为1 998 bp，但两者具有一定的相似性，并且都与水稻、苜蓿、拟南芥和小麦等物种中的ARF基因具有较高相似性，说明ARF基因在植物中比较保守。

有研究表明拟南芥中ARF基因的过量表达，可以导致其生长速度加快和叶面积增加(Gebbie et al., 2005)；在烟草中该基因的过量表达可以导致细胞的死亡(Lee et al., 2003)；有研究从小麦后代中分离到了一个过量表达的ARF基因(TaARF)，并对该基因的表达情况进行分析，发现该基因在小麦的根中优先表达，其在后代的表达量要超过双亲(Kobayashi-Uehara et al., 2001)，这表明该基因可能参与植物的生长发育过程。现在ARF基因已经从小麦、胡萝卜(Asakura et al., 2007)、拟南芥、棉花(Ren et al., 2004)和水稻(Youssefian et al., 1993)等植物中得到全长克隆，并通过研究发现该基因与细胞膜内运输、信号转导以及构成细胞的骨架有关。

本研究首次从香蕉中克隆到ARF3基因，作为ARF基因家族的成员之一，在病原菌侵染香蕉根系后12 h，该基因的表达量达到最高，以后逐渐降低，呈现一定的规律。说明香蕉ARF3基因可能与香蕉枯萎病的发生存在着相关性。可能是由于香蕉受到枯萎病菌感染后，寄主细胞接收到此信号，细胞内物质运输途径发生了变化，启动了该基因的表达。目前对于ARF基因家族的研究主要是从不同物种该基因家族的结构分析进行研究。对于该基因在各物种中调控表达原理的研究还不甚清楚。本研究结果为科学合理的评价ARF基因家族功能和ARF3基因与香蕉抗性的相关性提供参考，为进一步研究该基因在香蕉里的调控表达途径提供良好的基础，为香蕉的转基因育种提供借鉴。

3材料与方法
3.1材料
巴西蕉(Musa acuminata)无菌苗、枯萎病菌接种后巴西蕉苗均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所植物离体繁殖与保存中心提供。RNA提取所用试剂由上海生工公司提供，RACE试剂盒购自Clontech公司，PMD-18T-Vector、限制性内切酶、PCR所用试剂和逆转录试剂盒购自Promega公司。

3.2香蕉组培苗RNA的提取及香蕉ARF3基因5’-RACE和3’-RACE第一链cDNA的合成
提取方法参照(王玉成等, 2006)一种适用范围广的RNA提取方法。

3.2.1 5'-RACE第一链cDNA的合成
取RNA样品3 uL，5’CDS PrimerA 1 μL，SMART ⅡA oligo 1 μL于离心管中，混匀并离心；70℃，2 min；冰上冷却2 min；加入10×Buffer 1 μL，DTT (10 mmol/L) 2 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 4 μL，逆转录酶0.5 μL；混匀，42℃，1.5 h；加入20 μL的EDTA Buffer；72℃，7 min，-20℃保存备用。

3.2.2 3’-RACE第一链cDNA的合成
取RNA样品3 μL，3’CDS PrimerA 1 μL于离心管中，混匀并离心；70℃，2 min；冰上冷却2 min；加入10×Buffer 1 μL，DTT (10 mmol/L) 2 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 4 μL，逆转录酶0.5 μL；混匀，42℃，1.5 h；加入20 μL的EDTA Buffer；72℃，7 min，-20℃保存备用。

3.3香蕉ARF3基因5’-RACE和3’-RACE PCR扩增
3.3.1香蕉ARF3基因5’-RACE PCR扩增
以合成的5’-RACE第一链cDNA为模板，以5’-GSP1 (GCAATAAGCGTGCTCAAGTGTT)和通用引物UPM (试剂盒自带)为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物稀释50倍为模板，以5’-GSP2 (CACCTGTTGCCACTTCTCATAC)和NUP (试剂盒自带)为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件参照RACE试剂盒说明书。

3.3.2香蕉ARF3基因3’-RACE PCR扩增
以合成的3’-RACE第一链cDNA为模板，以3’-GSP1 (GATTTTCATTTGGCTTTGTCGT)和通用引物(UPM)为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物稀释50倍为模板，以3’-GSP2 (AAGACAGTAGAATGAATGGGAGC)和NUP为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件参照RACE试剂盒说明书。

3.4 PCR产物的克隆与重组质粒鉴定
分别将5’-RACE和3’-RACE PCR产物与PMD-18T Vector载体连接，16℃连接30 min，取连接产物5 μL加入到50 μL DH5α冰浴30 min，42℃水浴60 s，冰上放置2 min，加入液体LB培养基，37℃，200 rpm培养1 h，取100 μL菌液涂布在含有Amp 100 mg/L的LB固体平板上，倒置平板于37℃培养8~12 h。挑选白色菌落加入到含Amp 100 mg/L的LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养8 h左右，挑选阳性克隆的菌液进行测序。测序后将获得的5’-cDNA和3’-cDNA序列进行拼接，根据序列的开放阅读框设计上下游引物进行PCR得到目的基因全长。

3.5香蕉枯萎病原菌侵染根系后不同时间ARF3基因的表达情况
采用盆栽伤根淋菌法接种，每盆种1株香蕉苗，每盆灌50~60 mL孢子悬浮液于香蕉苗根部。依次采取病原菌侵染后0、6 h、12 h、24 h和3 d的香蕉根系，分别提取RNA并反转录成cDNA。反转录具体步骤为：在离心管中依次加入RNA样品1 μL、oligo dt primer (50 μmol/L) 1 μL、Random primer (50 μmol/L) 1 μL、dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL、Rnase free Water 6 μL，混匀，65℃ 5 min，放置冰上2 min，加入5×primescript Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、Primescript Reverse Transcriptase 0.5 μL、Rnase free Water 5 μL，42℃ 1 h，70℃ 15 min后保存。

根据香蕉的保守序列设计Actin基因上下游引物分别为Actin-F (ACAGTGTCTGGATTGGAGGC)和Actin-R (GCACTTCATGTGGACAATGG)，设计的香蕉Actin基因长度为217 bp。通过调整侵染根系后不同时间段的反转录产物浓度，并进行PCR反应，使Actin基因的表达量处于一致水平。ARF3基因RT引物为RT-F (AGGCAATAAGCGTGCTCAAGT)和RT-R (GGTACTGAAACCGAGAAGGATATG)，扩增片段大小为500 bp。PCR反应优化体系为：10×Buffer 2.5 μL、dNTP Mix (2.5 mmol/L) 2 μL、Taq酶0.2 μL、引物各加0.5 μL、模板用量根据调整的结果加入，补齐无菌水至25 μL体系。PCR反应程序：94℃ 5 min，94℃ 45 s，59.3℃ 45 s，72℃ 1 min，29个循环，72℃ 10 min。

作者贡献
杜中军完成本研究的实验设计；杨浩、唐志鹏和徐立完成数据分析，论文初稿的写作；徐立和唐志鹏参与实验设计，实验结果分析；李志英是资助项目的负责人，指导实验设计，修改论文。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(30760148)和农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室开放基金(KFKT-2011-07)共同资助。感谢农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室提供试验平台。

参考文献
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